（一）适用范围
本操作说明适用于PBMC、CD3、CD4、CD8、CD19、NK等冻存细胞的复苏操作过程。
（二）主要试剂
复苏培养基：含有20%灭活FBS的RPMI-1640培养基，复苏1管细胞用量为30mL。
注：10%-20%灭活FBS均可，推荐20%灭活FBS。
IMDM，DMEM，MEM培养基均可，推荐RPMI-1640培养基。
（三）仪器设备
恒温水浴锅、生物安全柜（超净工作台）、离心机。
注：如无恒温水浴锅，用温度37±3℃温水亦可。
（四）复苏操作流程
打开恒温水浴锅，水温设置为37℃。
将复苏培养基孵育至37℃，在生物安全柜内，取9 mL复苏培养基15 mL离心管。
从液氮罐或超低温冰箱取出冻存管，用钳子夹住冻存管盖子边缘，迅速放入37°C水浴中均匀快速的水平摇晃（勿将管盖浸入水中），直至冻存管中冰晶完全融解，停止水浴（约90s-120s，确定完全融解后再进行转移）。
用75%酒精擦拭冻存管表面以及盖子，在生物安全柜内打开冻存管，并把冻存管内溶液用移液器转移到装有9 mL复苏培养基的15 mL离心管内（转移时吸取和打出液体要轻柔缓慢，15s均匀吸取/打出1mL细胞悬液）。
吸取1 mL复苏培养基洗涤冻存管，再将洗涤液转移到15 mL离心管内，按以上步骤重复洗涤冻存管一次。轻轻吹打5-7次混匀细胞，离心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均为9）。
离心后，弃上清，加入复苏培养基至10mL，轻轻吹打重悬细胞，离心（20℃，400×g，10 min，accel/brake均为9）。
离心后，弃上清，吸去残留液体，加入复苏培养基（根据计数需要计算加入复苏培养基的体积，如用血球计数板进行计数，推荐重悬浓度5-10M/mL），轻轻吹打重悬细胞，避免气泡。
对重悬均匀的细胞悬液进行数量和活率测定。
（五）复苏注意事项
为避免细胞损失太大，复苏过程尽可能使用15mL离心管。
如果储存冻存细胞的设备距离水浴较远，应用干冰进行转移，避免冻存细胞在室温中暴露太久。
融解摇晃过程中，不可将冻存管管盖浸入水中，以免水进入管中，造成污染。
水浴后不可颠倒或倾斜冻存管，以免造成细胞损失。
细胞水浴过程操作要稳定快速，转移细胞到离心管以及吹打时操作要轻柔缓慢，切勿快速吹打刚刚复苏的细胞。
减少弃上清后的液体残留，以保证计数的准确性，但去上清时不可吸到管底细胞。
复苏后细胞会在一个小时左右恢复到最佳状态，如需对细胞进行损伤性处理，请等待细胞活性达到最佳后进行。
如需将细胞放置较长时间才能进行实验，则加入复苏培养基至10mL，37℃培养箱内静置或摇床上震荡。
应按本说明进行复苏操作，且复苏操作过程不能有时间停顿，以保证细胞活性。
